A Shaker-IR (N-típusú inaktivációtól mentes) kálium csatornák egy aktivációs és egy a C-típusú inaktivációért felelős inaktivációs kapuval rendelkeznek.A két kapu egymással csatolt,de a C-típusú inaktiváció molekuláris mechanizmusának részletei máig sem tisztázottak.Munkám során arra kerestem a választ, hogy az inaktivációs kapu képes-e az aktivációs kaputól függetlenül mozogni,azaz megvalósulhat-e a csatornák inaktivációja közvetlenül a zárt állapotból.
Méréseimhez olyan mutáns csatornákat használtam, amelyekben az S6-os transzmembrán helikális szegmensek 474-es pozíciójú aminosavait ciszteinekre cserélték,melyek kizárólagosan nyitott aktivációs kapu mellett hozzáférhetőek az intracelluláris oldal felől alkalmazott Cd2+ számára.A Cd2+ irreverzibilis kötődése a konduktancia elvesztését eredményezi,így a modifikációs reakció az ionáramok mérésével jól monitorozható.A méréseket tsa_201 sejtekbe transzfektált T449A/V474C csatornákon végeztem a patch-clamp technika feszültség-zár üzemmódjában,inside-out konfigurációban.
A kísérleteim során alkalmazott protokoll három, egyenként 5ms hosszúságú depolarizáló impulzust tartalmazott. Az első és a második impulzus között 20s-ig a patchet előbb Cd2+ hiányában, majd különböző Cd2+ koncentráció jelenlétében olyan membránpotenciálon tartottam, ahol az előzetesen elvégzett biofizikai karakterizálás alapján makroszkópos áram nem detektálható, de a csatornák inaktivációja már megfigyelhető. A második depolarizáló impulzust követően a patchet 60s-on keresztül -120mV-os tartófeszültségen tartottam,amely elegendő az inaktivált állapotból zárt állapotba való visszatéréshez.
Az így kapott csúcsáramok felhasználásával meghatározott relatív visszatérő áramhányad a kontroll mérések esetében ~1, 20 mikroM-os Cd2+ koncentráció mellett 0,84±0,04 (n=6), míg 200 mikroM-os Cd2+ koncentráció mellett 0,19±0,12 (n=3). Látható, hogy Cd2+ jelenlétében a csatornák kisebb hányada tér vissza az inaktivált állapotból, mint a kontroll mérések esetén, ami fokozódik a Cd2+ koncentráció növelésével. Mindez azt támasztja alá, hogy a csatorna aktivációja megelőzi az inaktivációs kapu záródását, azaz inaktiváció közvetlenül zárt állapotból nem valósulhat meg.