Apoptózist indukáló Tet-on eukarióta expressziós vektorok ősszeállítása és vizsgálata

A szintetikus biológia új szalagcím a biológiai kutatásban. Olyan eljárásokat takar, amelyek különböző forrásból származó biológiai elemekből célszerűen tervezett rendszereket igyekeznek létrehozni a mérnöki elme tervezőkészségével múlva fölül, egészítve ki azt, amit a természet létrehozott.
A szintetikus biológia és az élő sejt-terápia házassága azzal kecsegtet, hogy sejteket tudunk majd felruházni tetszőleges funkciókkal olyan genetikai hálózatok formájában, melyek ideális esetben a szervezetben farmakonokkal vezérelhetők. Az általunk összeállított tetracyclin szabályozta expressziós rendszerben az apoptózis az implementált funkció, másrészt, úgy is tekinthetjük, mint ”kikapcsoló” mechanizmust, mely lehetővé teszi, hogy egy mérnökileg módosított sejt, miután elvégezte feladatát, elhaljon, így időleges hatást tudjon kifejteni szöveti környezetben. A létrehozott rendszerben a baktériális eredetű TetR (tetracyclin represszor) protein kötődni képes egy a citomegalovírus genomból származó promóter előtti Tetracyclin Reszponzív Elemhez (TRE) megakadáyozva ezzel a promóter által hajtott gén kifejeződését. Ezt a gátlást doxycyclin (egy stabil tetracyclin analóg) adásával felfüggeszthetjük, a szabályozott gén kifejeződését biztosítva. A klónozás során a pSB1A3 ampicillin rezisztenciát kódoló hordozó vektort retrikciós enzimekkel megnyitottuk és a TRE-CMV (Tetraciklin válaszadó elem-minimál Citomegalovírus promóter), Bax (apoptózist indukáló protein) és a PolyA (transzkripció végét jelző szekvencia) inzerteket beillesztettük. A klónozás sikerességét restrikciós emésztéssel, az inzert méretek alapján ellenőriztük. A restrikciós analízis igazolta a pSB1A3-TRE-CMV-Bax-polyA expressziós vektor kialakításának sikerességét. A génkifejeződést fehérje szinten Western-blottal akarjuk vizsgálni, anti-Bax és hasított PARP antitesteket alkalmazva. Tervezzük még további apoptózis markerek kimutatását, sejthalál méréseket, valamint a Tet-On rendszer doxycyclin függésének vizsgálatát.