Elméleti háttér: A humán von Willebrand faktor (VWF) központi szerepet tölt be a primer hemosztázis folyamatában. Mennyiségi vagy minőségi defektusa a von Willebrand betegség oka (VWB). A betegség diagnosztikájában fontos a VWF:Ag szint- és aktivitás-meghatározás, illetve a VWF-multimereloszlás analízise. A VWF kollagénhez való kötődésén alapul (VWF:CB) az aktivitást merő módszer.
Az irodalomban vitatott a kollagén típusának és a mintahígító puffernek a kérdése.
Célkitűzés: A VWF kollagén kötő aktivitásának összehasonlítása humán I-es és III-as típusú kollagént és kazeint tartalmazó mintahígító puffert alkalmazva.
Módszer: ELISA lemezeket I-es és III-as típusú humán kollagénekkel fedtem, párhuzamosan VWF ellenes antitesttel VWF:Ag méréshez. Mintaként gyári standardet, normál és patológiás kontrollokat hígítottam 0,1% tTween-20 tartalmú, foszfáttal pufferelt fiziológiás sóoldattal (PBS-T) vagy még 2% kazeinnel kiegészített oldattal (PBS-T-C). A lemezeket 2 óra inkubálás, majd mosás után enzimjelölt VWF antitesttel inkubáltam. Ismételt alapos mosás után a kötődött VWF-ral arányos mennyiségű 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) szubsztrát átalakulását 450 nm-en mértem. Az eredményeket Excel és Prism programokkal értékeltem.
Eredmények: A standardsor pontjaira illesztett normalizált görbék egyezőek a két kollagén esetében PBS-T-vel és PBS-T-C-vel hígítva a mintákat. Azonban a mérés tartománya PBS-T-vel hígítva 0,1-20 PBS-T-C-vel hígítva 2-50 ng/ mérőhely. Normál kontroll esetén a VWF:CB/VWF:Ag ráta I-es és III-as típusú kollagénre átlagosan 1.04 és 1.16, míg patológiás kontrollnál 1.13 és 0.84 (n=12). A kereskedelmi és a laboratóriumunkban preparált különböző humán kollagénekkel azonos eredményeket kaptam.
Konklúzió: A VWF:CB eredmények közötti különbség az I-es és III-as típusú kollagénekkel a mérés hibahatárán belül van. A különböző pufferekkel a mérés tartománya jelentősen különböző, ezért rutin szerűen kazein nélküli PBS-T-t alkalmazását javasoljuk.