A titin a szervezetben található legnagyobb méretű fehérje (~3,4MDa), mely a miofibrillum felépítésében, a kontrakció létrejöttében, valamint a sejt passzív elasztikus tulajdonságainak meghatározásában játszik szerepet. A titin gén mutációja állhat számos betegség hátterében, szerepe a diasztolés szívelégtelenség patológiájában pedig intenzív kutatások tárgyát képezi.
Célunk olyan metodikai módszer kidolgozása volt, mellyel a titint elválaszthatjuk a többi miofibrilláris fehérjétől, így megkönnyítve biokémiai vizsgálatok elvégzését. Gélszűrést és AF4-t (asymmetric flow field flow fractionation) használtunk titin humán szívizomból történő izolálásához.
Kollaborációs partnerünk által kidolgozott HPLC futtató puffer kálium tartalma csapadékot képzett a szívizomsejtek feltárására használt pufferrel, melyet turbidimetriás mérés is megerősített (keverék: 650±93OD, kontroll: 53±2OD), emiatt kálium mentes oldatokban folytattuk az elválasztást. AF4 alapú szeparálás esetén a nagyobb molekulaméretű fehérjék retenciós ideje hosszabb, mint a kisebb méretűeké (albumin: 66kDa, 8,8perc; tireoglobulin: 669kDa, 11,0perc). Az elválasztott miofibrilláris fehérjék frakcióit összegyűjtve és töményítve gél elektroforézissel vizsgáltuk az elválasztás hatékonyságát, mely elégtelennek bizonyult. A módszer optimalizálása során kapott eredményekből következett, hogy a futtatás idejét növelve a szívizom homogenizátum egyre nagyobb mennyisége csapódott ki (50,23%) a kontroll, albumin oldathoz képest (16,77%). Kémcsőkísérletekkel megállapítottuk, hogy minimálisan 6M urea és 3% SDS szükséges a fehérje-homogenizátum oldatban tarásához. Mivel ilyen tömény oldatot AF4 esetén nem alkalmazhattunk, áttértünk gélszűrésre. Gélszűrés során a nagyobb méretű fehérjék retenciós ideje kisebb (tireoglobulin: 8,65perc; albumin: 9,77perc). Az elválasztott miofibrilláris fehérjék gél elektroforetikus képe alapján a szeparálás sikerült, titinen kívül más fehérje nem detektálható az első frakciókban.
Sikeresen beállítottunk egy olyan új eljárást, mellyel a titin oldott állapotban egyetlen lépésben elválasztható a miofibrillum többi fehérjéitől, ezzel lehetőséget teremtve biokémiai vizsgálatok egyszerűbb elvégzésére