Mutáns TIMAP expressziós konstruktok előállítása

A TIMAP (TGF-beta-inhibited membrane associated protein) egy 64 kDa molekulasúlyú fehérje, amelynek expressziós szintje az endotél sejtekben igen magas. A fehérjét szerkezeti rokonság alapján a protein foszfatáz 1 (PP1) enzim MYPT regulátor alegység család tagjának tartják. Szerkezetében ugyanis megtalálható a PP1c (PP1 katalitikus alegysége) kötő motívum, ankirin-szerű ismétlődések és a membrán lokalizációjáért felelős prenilációs motívum, valamint egy potenciális nukleáris lokalizációs szignál (NLS). Munkacsoportunk immunfluoreszcenciás kísérletekben a TIMAP-ot elsősorban a sejtmembránban, valamint a sejtmagban detektálta. Feltételezzük, hogy a membránban az úgynevezett ERM (ezrin-radixin-moezin) fehérjék foszforilációs szintjét befolyásolja a PP1c szabályozásával. A sejtmagban lokalizálódó TIMAP fiziológiás szerepe viszont nem ismert. Korábban létrehoztunk a vad típusú TIMAP bakteriális és emlős expressziójához alkalmas vektor konstruktokat. Célunk volt olyan TIMAP mutáns forma előállítása, amely a feltételezett NLS szekvenciát nem tartalmazza. Az NLS szekvencia a fehérje N-terminális végéhez közel (35-51 aminosavak), a PP1c kötő motívum és az ankirin ismétlődések előtt található. Ezért olyan oligonukleotid primereket terveztünk (emlős és bakteriális expresszióhoz), amelyek a TIMAP kódoló szekvencia 5’ végen trunkált változatának PCR sokszorosítását és bakteriális pGEX-4T-3 illetve emlős pcDNA3.1 myc-HisA vektorokba történő szubklónozását tették lehetővé. Az előállított konstruktokat szekvenálással ellenőriztük. A vad típusú és a trunkált (az első 58 aminosavat nem tartalmazó) TIMAP fehérjét BL21 és HeLa sejtekben expresszáltattuk. A rekombináns fehérjék detektálásához Western blot kísérletet végeztünk és HeLa sejteken (amelyben endogén TIMAP nincs jelen) immunfluoreszcencia vizsgálatot tervezünk. Az előállított konstruktokat a TIMAP magi lokalizációjának vizsgálatában tervezzük felhasználni.