Mutáns Shaker-IR kálium csatorna C-típusú inaktivációból való visszatérésének tanulmányozása nyitott állapotban rögzített aktivációs kapu mellett

A Shaker-IR kálium csatorna két kapuval, egy aktivációs és egy a C-típusú inaktivációért felelős inaktivációs kapuval rendelkezik. Korábban bizonyítást nyert, hogy a két kapu egymással csatolt, az inaktivációs kapu állapota befolyásolja az aktivációs kapu mozgását. A munkám során arra kerestem a választ, hogy ez a csatolás kettős természetű-e, vagyis az aktivációs kapu nyitott állapotban való rögzítése befolyásolja-e az inaktivációs kapu nyitását, így a csatornák inaktivált állapotból való visszatérését.
Méréseimhez olyan mutáns Shaker-IR csatornát használtam, amelyben az S6-os transzmembrán helikális szegmentumok a 476-os pozíciókban ciszteineket tartalmaztak. Nyitott aktivációs kapu mellett intracellulárisan alkalmazott Cd2+ hatására az alegységek 476-os pozícióban levő ciszteinje és egy szomszédos alegység 486-os pozíciójában található natív hisztidinje között létrejövő Cd2+-híd révén az aktivációs kapu nem tud bezáródni, így az a nyitott állapotban rögzíthető. A méréseket tsa_201 sejtekbe transzfektált T449A/V476C csatornákon végeztem a patch-clamp technika feszültség-zár üzemmódjában inside-out konfigurációban.
Kísérleteimben 2 s hosszúságú, -120 mV-ról +50 mV-ra történő depolarizáló impulzusokat alkalmaztam először Cd2+ hiányában, majd Cd2+ jelenlétében. Az egyes impulzusok közti idő mindvégig 60 s volt, ami a kontroll körülmények között elegendő a csatornák inaktivált állapotból zárt állapotba való visszatéréséhez. A 20 mikroM-os Cd2+ koncentrációjú oldatot gyorsperfúzós rendszerrel, különböző időtartamokban (0,2 s illetve 1 s) vezettem a kitépett patchre. A Cd2+ expozíció kezdetén a csatornák teljes inaktivációja volt megfigyelhető.
Kontroll körülmények között a depolarizáló impulzusok során kapott csúcsáramok értéke nem változott. Ezzel szemben Cd2+ jelenlétében a csatornák kisebb hányada tért vissza az inaktivált állapotból a zárt állapotba, így az egymást követő impulzusok során kapott csúcsáramok értéke a Cd2+ expozíció időtartamától függően irreverzibilisen csökkent (n=4). Mindez azt támasztja alá, hogy az aktivációs kapu záródása alapvető feltétele az inaktivációs kapu nyitásának, ezáltal a csatornák inaktivált állapotból való visszatérésének.