Protein foszfatáz-1 szabályozása rns interferenciával és inhibitor fehérje expressziójával
Nyomtatóbarát változat A sejtek életképességében fontos szerepe van az apoptózist szabályozó fehérjék foszforilációjának. A fehérjék foszforilációs szintje a protein kinázok és foszfatázok aktivitásának arányától függ. A foszfoszerin/treonin specifikus protein foszfatáz-1 (PP1) enzim pl. a retinoblasztóma fehérje (pRb) foszforilációs állapotát, és ezzel a normál és daganatos sejtek sejtciklusát is szabályozza. A PP1 ezen hatását az enzimet specifikusan gátló membránpermeábilis foszfatáz inhibitor toxinnal igazolták.
Egyik célkitűzésünk az volt, hogy a PP1 katalitikus alegység (PP1c) csendesítését eredményező gátló RNS hatását tanulmányozzuk HeLa sejtekben a daunorubicinnel (DNR) indukált sejthalálra és a pRb foszforilációjára. Kimutattuk, hogy a PP1c izoformák csendesítését okozó RNS jelentős mértékben csökkentette a PP1c expresszióját, ami a pRb növekvő foszforilációjában és a sejtek DNR jelenlétében mért mérsékelt mértékű túlélésében is megnyilvánult.
Daganatos sejtekben a PP1 aktivitását foszforilációval aktiválható 17 kDa inhibitor fehérje (CPI17) is szabályozza. A KEPI fehérje a CPI17-hez hasonló, emlőtumor antigénként is ismeretes, ezért másik célkitűzésünk volt a KEPI expressziója daganatos sejtekben és szerepének tanulmányozása a PP1 szabályozásában. A Flag peptiddel kapcsolt KEPI fehérjét kódoló plazmidot először HEK293 sejtekbe transzfektáltunk és az expresszió hatásfokát (kb. 50-60%) immunfluoreszcenciával és Western blottal ellenőriztük. A KEPI fehérjét anti-Flag antitesttel kapcsolt Sepharose oszlopon sikeresen tisztítottuk. A KEPI-t MCF7 emlőtumor, valamint THP-1 leukémiás sejtvonalakban is expresszáltuk, igaz a HEK sejteknél kisebb hatásfokkal. Kísérleteink az expresszió hatásfokának növelésére, a KEPI foszforilációs állapotának és fehérje kölcsönhatásainak vizsgálatára irányulnak.
Eredményeink megerősítették a PP1 enzimnek a sejtek életképességének szabályozásában betöltött szerepét. A PP1 gátló fehérjék expressziójával kísérletet tettünk a PP1-et szabályozó natív fehérjék szerepének tanulmányozására.
Támogatók: Támogatók: Az NTP-TDK-14-0007 számú, A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése helyi konferencia keretében, az NTP-TDK-14-0006 számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása, NTP-HHTDK-15-0011-es A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése 2016. évi helyi konferencia keretében, valamint a NTP-HHTDK-15-0057-es számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása című pályázatokhoz kapcsolódóan az Emberi Erőforrás Támogatáskezelő, az Emberi Erőforrások Minisztériuma, az Oktatáskutató és Fejlesztő Intézet és a Nemzeti Tehetség Program
